PCR反應(yīng)過程
PCR反應(yīng)過程有以下3個(gè)步驟
1.變性將反應(yīng)體系混合物加熱到94℃，維持較短時(shí)間（大約15 s-30 s），使目標(biāo)DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA作為反應(yīng)模板。
2.退火將反應(yīng)體系冷卻至特定的溫度（引物的TM值左右或以下），引物與DNA模板的互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，形成模板引物復(fù)合物。
3.延伸將反應(yīng)體系的溫度提高到72℃并維持一段時(shí)間，引物在耐熱聚合酶的作用下，以引物為固定起點(diǎn)，以4種單核苷酸（dNTP）作為底物合成新的DNA鏈。以上三步作為一個(gè)循環(huán)重復(fù)的進(jìn)行，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一循環(huán)的模板。如此循環(huán)數(shù)十次，從而使目的基因得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，達(dá)到檢測(cè)或獲取基因的目的。
PCR儀的分類
根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)可以將PCR儀分為：普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等幾類。
普通PCR儀
一般把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運(yùn)行。主要是用作簡(jiǎn)單的，對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。
主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、檢疫等。
梯度PCR儀
一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。
因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同的DNA片段其最適合的退火溫度不同，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的最適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時(shí)間，也節(jié)約經(jīng)費(fèi)。
在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。真正的梯度，是每一排管都有精確的加熱控溫探頭。
梯度PCR儀多應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu)。
原位PCR儀
有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通過替換模塊進(jìn)行多用途開展實(shí)驗(yàn)工作。是用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀。如病原基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。可保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA，還能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置。于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實(shí)用價(jià)值。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀
在普通
PCR儀設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上增加熒光信號(hào)激發(fā)、采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。
它的PCR擴(kuò)增原理與普通PCR擴(kuò)增原理相同，在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果會(huì)通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)，并連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記時(shí)，使用單通道；有多種熒光標(biāo)記時(shí)選用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物。因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)多種目的基因的功能。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量試劑、通用電腦和自動(dòng)分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)
熒光定量PCR儀比普通的PCR儀多了熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要是用來定量分析和確定基因轉(zhuǎn)錄水平的，而普通PCR儀是做定性分析和擴(kuò)增基因片段，定量PCR儀可以做普通PCR儀的工作，但是成本太高。
樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大，這樣可以獲得最準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。
熒光定量PCR儀特點(diǎn)
1．特異性強(qiáng)：引物和探針的“雙保險(xiǎn)”，避免檢測(cè)的假陽(yáng)性。
2．靈敏度高：分析PCR產(chǎn)物的對(duì)數(shù)期，自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了許多人為因素干擾。
3．避免污染：全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理。
4．實(shí)現(xiàn)定量：運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合Ct值進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
5．高效低耗：可實(shí)現(xiàn)一管多檢。
6．操作簡(jiǎn)便：在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，不必接觸有害物質(zhì)。
7．快速：反應(yīng)時(shí)間<1.5小時(shí)。
PCR常見問題
PCR 過程中免不了遇到各種問題，如無擴(kuò)增條帶、PCR產(chǎn)物量過少、擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散、條帶大小與理論不符等等。
1.無擴(kuò)增條帶
（1）酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。
（2）模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。
（3）變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不徹底。
（4）反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10分鐘。
（5）引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。
（6）引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
（7）DNA凝膠電泳時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。
2.PCR產(chǎn)物量過少
（1）退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。
（4）引物量不足。增加體系中引物含量。
（5）延伸時(shí)間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延伸時(shí)間。
（6）變性時(shí)間過長(zhǎng)。變性時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。
（7）DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈
3.擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
（1）酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。
（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過高?？蛇m當(dāng)降低其用量。
（4）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
（5）引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。
（6）循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
（7）退火溫度過低。
4.擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶（雜帶）
（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。
（2）循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。
（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
（4）退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
（5）樣品處理不當(dāng)。
（6）Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。
（7）若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問題。
（8）復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。
（9）反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。
（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
（11）引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。
（12）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。
5.陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶
試劑，槍頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。
6.條帶大小與理論不符
（1）污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。
（2）模板或引物使用錯(cuò)誤。更換引物和模板。
（3）基因亞型。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。
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